科学家发现原发性家族性脑钙化症新隐性致病基

在该研究工作中,研究人员发现PRRT2是一个新的突触蛋白,可与突触蛋白Syntaxin1A及SNAP25相互作用,影响神经元突触内SNARE蛋白复合体的形成,从而调控囊泡入坞到突触前膜的过程。尽管关于细胞囊泡运输和调控机制的研究已相对完善且非常重要,但人们从未发现该分子的调控作用,该研究揭示了突触囊泡转运上膜过程中的一个新“车闸”。研究人员制备了一系列的PRRT2基因突变小鼠,涵盖模拟病人体内突变位点、脑内选择性基因敲除、病毒介导的小脑内局部基因敲除、小脑颗粒细胞内选择性基因敲除等方式,发现当PRRT2在体内的功能缺失后,小鼠会在癫痫发作后、高温环境下以及光遗传刺激小脑的情况下出现阵发性运动失调和肌张力障碍等症状,表型与病人的症状十分相像。该症状的严重程度同蛋白表达量负相关,并可被抗癫痫药卡马西平所改善。研究人员使用Ai32、GluN2C-iCre、Prrt2-floxed等三种转基因鼠,制备出可在小脑内颗粒细胞中特异地自表达光遗传通道蛋白CHR2而同时选择性地敲除PRRT2基因的小鼠,进行全细胞电生理记录发现,PRRT2突变小脑内颗粒细胞的平行纤维与浦肯野细胞之间的突触传递改变,造成浦肯野细胞放电异常,导致小脑功能紊乱和阵发性运动障碍。多年来,PKD研究中存在的条件限制是缺乏有效的动物模型,该研究首次制备了小鼠PKD模型,利用多种物理或化学范式,为后续开展药物开发或干预治疗探索提供了稳定可靠的动物疾病模型。综上所述,该研究详细而系统地揭示了PRRT2在脑内的表达和功能,首次在体确认了PKD发病的PRRT2功能缺失机制,揭示了PRRT2在突触SNARE复合体形成和囊泡释放中的重要调节作用,确定了小脑尤其是小脑颗粒细胞在PKD发病过程中的核心作用,解决了一直困扰该研究领域的关于PKD关键调控脑区环路的争论,推进了人们对发作性运动障碍发病机制的认识,同时对人们理解突触传递的最新分子调控机制也很有启发。

面对这一问题,陈万金团队与山东大学齐鲁医院、福建医科大学附属漳州市医院等多家医疗单位合作,近年来收集了数十个PFBC家系,通过全外显子测序、Sanger测序等方法,发现了6个隐性PFBC家系与MYORG 基因突变共分离。MYORG 基因,又名KIAA1161NET37,位于染色体9p133上,编码含有714个氨基酸的蛋白,是糖基水解酶31家族的成员,其功能与相关信号通路研究鲜有报道。

新闻中心讯 日前,来自复旦大学、福建医科大学与中国科学院上海神经科学研究所的研究人员在运动障碍疾病研究中取得新突破。他们应用先进的全外显子测序技术,在8个家族性发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia,简称为PKD)家系中发现PRRT2基因上存在3种截短突变,通过家系内共分离分析、大样本正常对照测序验证、单倍型分析等多层次验证,结合PRRT2基因表达及蛋白定位研究,最终成功克隆了家族性PKD的第一个致病基因PRRT2,对充分理解该病的分子发病机制以及提高本病临床诊治水平具有深远意义。这一研究成果于2011年11月20日在线发表在《自然遗传》(Nature Genetics)杂志(影响因子为36.377分)。

经过多年的联合攻关,研究人员构建了miR-137全身敲除小鼠以及神经系统特异敲除小鼠模型。实验发现,miR-137全身敲除或神经系统特异敲除的纯合子小鼠在出生后数周内即死亡。杂合子的miR-137敲低小鼠可以存活至成年。细胞水平检测发现,miR-137部分缺失会造成小鼠突触修剪、突触可塑性、突触蛋白表达等方面表型异常。

图2.研究发现总结模式图。小脑内的颗粒细胞中的PRRT2缺失,引起平行纤维和浦肯野细胞之间的突触传递异常,进而导致浦肯野细胞的放电异常,从而造成了运动障碍的出现。(封面图片由谭国鹤构思,Apex Science Media公司周舒扬等作图)。

我国拥有丰富的遗传病临床资源,临床与基础研究的密切合作有助于高效地取得原创性成果。正是基于这一共同理念,陈万金、王柠和吴志英(现任职浙江大学附属第二医院)早在2011年就与熊志奇团队合作鉴定了发作性运动诱发性运动障碍的首个致病基因PRRT2。随后数年,从分子、细胞、环路和行为层面,采用小鼠和食蟹猴模型进行了系统性的研究,初步架构了PKD发生的分子和环路机制,为开发治疗PKD的新方法提供了重要参考。

发作性运动诱发性运动障碍是一种运动诱发的以肢体和躯干阵发性舞蹈手足徐动症或肌张力障碍痉挛为特征的一种不常见的散发性、家族性或继发性疾病,临床上易被误诊为癫痫。家族性大部分呈常染色体显性遗传,少数也可隐形遗传。自上世纪90年代起,世界各国的科学家开始致力于定位PKD的致病基因,但到目前为止,科学家们对其基因定位及发病机制尚不清楚。

近日,中国科学院动物研究所、美国埃默里大学医学院、中国科学院干细胞与再生医学创新研究院、中国科学院大学、美国圣裘德儿童研究医院,东南大学等机构合作,首次提供了miR-137缺失导致精神疾病的在体实验证据,进一步揭示miR-137缺失类的精神疾病的分子调控机制。该研究11月5日在线发表于《自然—神经科学》。

图1.小脑是控制PRRT2相关运动障碍的关键脑区。A-C,腺相关病毒介导Cre/Loxp系统在小脑内局部敲除PRRT2表达,出现热诱导性运动障碍的发作;D-H,仅在小脑颗粒细胞中选择性敲除PRRT2表达,小鼠出现运动学习能力降低和热诱导性运动障碍发作。I-K,在小脑颗粒细胞缺失PRRT2的小鼠中,利用光遗传手段刺激小脑局部兴奋,导致诱发性运动障碍的出现。

脑钙化病是一种影响广泛的神经障碍性疾病,在老年人中发生率高达20%,由于其发病机制不清楚,临床上缺乏有效的治疗手段。原发性家族性脑钙化症以双侧基底节、小脑或其他脑区病理性钙化沉积为特征,其临床症状主要包括类帕金森氏症的进行性运动障碍、神经精神症状、构音障碍和认知障碍等。自2012年华中科技大学教授刘静宇发现首个PFBC致病基因SLC20A2以来, 其他实验室后续又发现XPR1、PDGFRB、PDGFB等致病基因。然而仍有50%以上的家族性患者的遗传因素尚未明确,且基于目前的四个基因也难以较好地构建PFBC的分子细胞病理机制。

由于共有6个不同的家系均含有同一种截短突变,为鉴定这一突变是否为来自同一祖先的“奠基者效应”,复旦大学泌尿外科研究所的徐剑锋教授利用其高通量的基因分析平台,迅速解决了这一问题。为了探讨PRRT2的蛋白功能及其与PKD发病之间的关系,该团队又与中国科学院上海神经科学研究所的熊志奇研究员团队合作,在短时间内完成了PRRT2基因表达及蛋白定位研究,结果进一步提示PRRT2为PKD的致病基因。

近年来,多项独立的全基因组关联分析研究发现,染色体上MIR137基因编码区(1p21.3,编码小分子非编码RNA miR-137)突变与精神分裂症的发生密切相关。

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近日,由福建医科大学附属第一医院神经内科教授陈万金、王柠团队与中国科学院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室研究员熊志奇团队合作,发现并鉴定了MYORG是原发性家族性脑钙化症(Primary Familial Brain Calcification,PFBC)的新致病基因。6月14日,神经科学杂志NeuronBiallelic mutations in MYORG cause autosomal recessive primary familial brain calcification 为题在线发表了这一成果。

皇家赌场游戏网站,这项工作完全是在国内自主完成的,采用最先进的分子生物学技术,巧妙地解决了20多年来困扰国内外科学家的难题。这一研究发现对于揭示PRRT2基因的功能,以及阵发性运动性运动障碍的诊断、治疗具有十分重要的意义。同时,PKD基因的克隆对其它类型的发作性疾病研究也具有重要的借鉴作用。

研究还发现,杂合子的miR-137敲低小鼠表现出明显的精神障碍,如刻板重复行为、社交能力下降、社交偏好受损、学习记忆功能缺陷等。为了深入揭示这些表型背后的分子机制,研究人员综合运用蛋白质组、转录组、分子生物学、生物化学等方法,鉴定出miR-137的一个关键靶基因,Pde10a (phosphodiesterase 10a)。通过给小鼠注射Pde10a特异性抑制剂(papaverine)、或者短发夹RNA病毒(sh-Pde10a),杂合子的miR-137敲低小鼠的刻板重复行为、社交能力、学习记忆功能得到了很好的改善。

该研究工作得到了科技部项目、中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金和上海市科委等的资助。

该研究由福建医科大学附属第一医院神经内科博士姚香平、中科院神经所副研究员程学文和福建医科大学博士研究生王冲、赵淼为共同第一作者,在陈万金、熊志奇和王柠的指导下共同完成。福建医科大学附属第一医院的多位医生、医学生在样本采集、测序分析等实验上提供了帮助。福建医大附属漳州医院博士陈雪娇,山东大学附属齐鲁医院博士赵玉瑛提供了部分珍贵的临床样本。美国北岸大学健康学院教授徐剑锋、神经所研究员杨辉、上海科技大学教授范高峰提供了指导,神经所光学成像平台、小鼠动物房和非人灵长类研究平台在小鼠制作、饲养和成像方面提供了大力帮助。该研究得到了国家自然科学基金、中科院战略性先导科技专项、科技部发展项目、国家临床重点专科建设项目的大力资助。

自2005年起,复旦大学附属华山医院吴志英教授与福建医科大学附属第一医院王柠教授带领的团队先后收集了8个家族性PKD家系,研究其致病基因定位。近两年来,随着新一代测序技术问世并在其它遗传病的基因克隆方面得到了良好的应用,该研究团队于2010年将全外显子测序技术应用到PKD家系的基因克隆上,在最大的家系(家系1)中选取了两个有代表性的病人以及2名无症状的家系成员进行分析,共获得了100多亿个核苷酸序列数据。结合前期基因定位以及国内外文献的研究结果,迅速将目标锁定在16号染色体的PRRT2基因,进一步直接测序验证发现了PRRT2基因截短突变,该结果在其它7个PKD家系中得到了证实,共发现了3种截短突变,并在1000名健康对照中进行验证。

中外合作研究揭示精神疾病发生调控机制

PKD是严重的中枢神经系统疾病,表现为非自愿性运动所诱发的肌张力障碍、舞蹈病、手足徐动症、颤搐或这些运动失调症状的组合,发作时没有意识丧失,多发于青少年时期。该病自1967年被Kertesz等详细描述以来,其确切的发病机制一直不明。熊志奇研究组此前与复旦大学华山医院教授吴志英、福建医科大学教授王柠课题组合作,发现了PKD首个致病基因PRRT2。作为第一个被鉴定出来的PKD致病基因,PRRT2在体内的生物学功能以及如何调控运动功能,是亟待研究解决的问题。

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“这些发现暗示papaverine等PDE10A抑制剂有可能成为miR-137缺失类的精神疾病的潜在药物。” 中科院动物所研究员滕兆乾表示,未来团队的研究工作重点将转向利用miR-137缺失小鼠模型、人多能干细胞与类脑体等技术手段,深入揭示miR-137缺失类的精神疾病的发病机制,评估与研发干预治疗精神疾病的药物。

近日,中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室熊志奇研究组,在小脑和运动障碍研究领域取得进展。相关研究成果以《PRRT2缺失造成小脑内的突触传递异常介导阵发性运动诱发性运动障碍》为题,在线发表在Cell Research上。研究人员系统地从分子、突触、细胞和神经环路水平解析了阵发性运动诱发性运动障碍(Paraxysmalkinesigenic dyskinesia, PKD)致病基因PRRT2在脑内的神经生物学作用及机制,为理解发作性运动障碍的发病机理和神经元突触囊泡转运的分子调控机制提供了新的认识。

图注:A. MYORG基因突变隐性遗传的家系一;B. 在2月龄小鼠大脑皮层中,Myorg基因与胶质细胞的标记分子S100b共标;C. 在9月龄Myorg基因纯合敲除的小鼠大脑内,钙沉积物染色阳性。

精神疾病是一类行为、认知、学习、情感等精神活动障碍的神经疾病。目前对其病因的认识尚不明确,且缺乏有效的治疗药物。

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通过与熊志奇团队合作,发现Myorg基因特异地表达在S100b阳性的星形胶质细胞中。随后,在新构建的Myorg-GFP模型小鼠上也证实了这一点。在8-9月龄的Myorg基因敲除的小鼠脑内,观察到双侧对称性脑钙化结节的发生。通过扫描电镜结合X射线能谱仪分析,发现钙结节的主要成分为钙、磷、氧等,与临床病人脑钙化的元素组分高度相似,证明MYORG常染色体隐性功能缺失型突变是重要的PFBC致病基因。

论文相关信息:

此前发现的PFBC四个基因皆为显性遗传,而该工作所发现的MYORG基因在PFBC中呈隐性遗传,在所有的PFBC家系中,MYORG突变比例达11%,为本病第二常见致病基因。有趣的是,MYORG突变在隐性家系中所占比例高达50%。在机制层面,之前研究认为脑钙化主要由周细胞及血脑屏障破坏所致,而该研究首次表明胶质细胞也是脑钙化发生的关键因素。

“我们在早期的研究工作中,利用基因过表达与敲低的慢病毒与逆转录病毒等技术已经证实了miR-137在神经发生、神经元成熟、突出可塑性、学习记忆等方面行使着重要功能。”论文通讯作者、中科院动物研究所研究员陈大华告诉《中国科学报》记者,但是miR-137缺失对个体精神活动是否有影响、有何影响、怎样影响等亟待解答的科学问题尚未攻破。

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